甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

崔 晓,丁渲攀，张西君，达举云，史金莲，张 勇*

(1.甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070；
2.甘肃动物生殖生理及繁殖调控重点实验室，甘肃 兰州 730070)

马子宫内膜炎(endometritis)是继马肠绞痛、病毒性呼吸道疾病之后第三大关键性疾病。高达25%～60%的不孕母马患有慢性子宫内膜炎，其可引起妊娠失败、早产难产、胎盘炎、新生儿败血症等疾病，严重影响马的繁殖性能，对马产业和农牧民造成了巨大的经济损失。在繁殖季节，子宫内膜感染的母马妊娠率从80%下降到20%[1-2]；
阴道积气和粪便污染容易造成马的抵抗力降低，从而引起阴道炎和细菌性子宫内膜炎[3]。细菌性马子宫内膜炎中最常见的致病菌是马链球菌，其次是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌[4-9]。因此建立一种快速准确的病原菌检测方法是防制马子宫内膜炎的关键。多重PCR是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增并对扩增产物进行检测，从而实现诊断多个靶标的技术，具有高效率、高通量和低成本的特性，被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域[10]。本研究建立了一种可以检测马子宫内膜炎主要致病菌多重PCR方法，为马子宫内膜炎的诊断和防制提供技术支持。

1.1 样品采集马子宫冲洗液采自甘肃省山丹县4个规模化养殖场。挑选不孕母马，经直肠检查、B超等临床检查确诊患有子宫内膜炎，用无菌注射器连接人工输精管向子宫内注入50～100 mL生理盐水后回抽冲洗液，4℃保存备用。

1.2 主要试剂大肠杆菌、金黄色葡菌球菌、马链球菌标准菌株均购自北京中科质检生物技术有限公司；
革兰染色液、营养肉汤、琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司；
无菌脱纤维绵羊血购自南京森贝伽生物科技有限公司；
细菌微量生化鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 细菌的分离鉴定采集的马子宫冲洗液经分离纯化后革兰染色镜检观察并进行生化鉴定。提取细菌基因组DNA，以16S rRNA通用引物进行PCR扩增，将扩增的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果经NCBI官网进行BLAST比对。

1.4 多重PCR引物的设计与合成根据NCBI数据库中已发布的金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌phoA基因和马链球菌fneB基因，设计3对特异性引物，由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

1.5 PCR引物的特异性试验以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、马链球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、马链球菌引物扩增，同时设置ddH2O为空白对照检测各引物的特异性。

表1 引物信息

1.6 PCR检测的灵敏性试验将各菌液稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8CFU/mL 8个浓度梯度，通过活菌计数法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、马链球菌进行菌液浓度测定，计算1 mL 菌液的浓度。以稀释后的3种菌株DNA为模板进行PCR反应，检测其灵敏性。

1.7 多重 PCR 方法建立及条件优化建立40 μL多重PCR反应体系：3种菌株DNA模板各1 μL，上、下游引物各在0.3～1.0 μL之间设置8个引物浓度，退火温度52～60℃ 进行优化。反应程序：95℃ 5 min；
95℃ 30 s，退火30 s,72℃ 30 s，反应34个循环;72℃终延伸5 min。

1.8 多重 PCR 检测方法临床效果评价将采集的马子宫冲洗液吸取20 μL接种到5 mL营养肉汤中，37℃培养24 h，提取细菌DNA，用建立的多重PCR方法检测。同时通过革兰染色、镜检、生化鉴定及16S rRNA等传统方法对样本中的病原菌分离鉴定，并对多重PCR和传统方法的结果进行比对。

2.1 病原菌分离及镜检对采集的子宫冲洗液进行病原菌的初步分离鉴定，分离得到的疑似金黄色葡萄球菌株在甘露醇高盐鉴别培养基长出金黄色菌落，其外围有一圈黄色的晕环，镜检呈蓝紫色葡萄状球菌(图1A、D)；
疑似大肠杆菌菌株在伊红美蓝鉴别培养基上长出紫黑色湿润并有典型的金属光泽菌落，镜检呈两端钝圆、粉红色短杆状(图1B、E)；
疑似马链球菌的菌株在绵羊血平板上长出圆形、β溶血半透明菌落，镜检呈单个、成双或链状排列的球菌(图1C、F)。将纯化后的菌落提取DNA，测序后在NCBI上进行BLAST比对，结果表明该地区4个马场临床型马子宫内膜炎致病菌主要为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌。

A～C.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌在培养基上的菌落形态；
D～F.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌革兰染色形态镜检

2.2 生化鉴定疑似金黄色葡萄球菌的分离株能发酵麦芽糖、蔗糖、甘露醇，不发酵木糖和棉子糖，尿素试验和硝酸盐还原试验阳性。疑似大肠杆菌的分离株能发酵甘露醇、山梨醇、葡萄糖等，吲哚试验和硝酸盐还原试验阳性。疑似马链球菌的分离株能发酵山梨醇，不发酵棉子糖和菊糖，吲哚试验和硝酸盐还原试验阴性。

2.3 PCR引物特异性检测结果显示，金黄色葡萄球菌(图2A)、大肠杆菌(图2B)、马链球菌(图2C)均能扩增出特异性条带，而其他细菌核酸及阴性对照均未出现特异性条带，表明设计的引物具有良好的特异性。

2.4 PCR检测的灵敏性试验单一PCR扩增结果表明金黄色葡萄球菌最低检测浓度为2.4×102CFU/mL(图2D)，大肠杆菌最低检测浓度为2.6×103CFU/mL(图2E)，马链球菌最低检测浓度为1.2×102CFU/mL(图2F)；
而在多重PCR反应中，金黄色葡萄球菌最低检测浓度为2.4×104CFU/mL，大肠杆菌最低检测浓度为2.6×103CFU/mL，马链球菌最低检测浓度为1.2×102CFU/mL(图3)。

A.金黄色葡萄球菌引物特异性(1.阴性对照;2.大肠杆菌;3.马链球菌兽疫亚种;4.肺炎链球菌;5.无乳链球菌;6～8.金黄色葡萄球菌)；
B.大肠杆菌引物特异性(1.阴性对照;2.金黄色葡萄球菌;3.马链球菌;4.肺炎链球菌;5.无乳链球菌;6～8.大肠杆菌)；
C.马链球菌引物特异性(1.阴性对照;2.金黄色葡萄球菌;3.大肠杆菌;4.肺炎链球菌;5.无乳链球菌;6～8.马链球菌)；
D.金黄色葡萄球菌引物敏感性(1～8.2.4×108，2.4×107，2.4×106，2.4×105，2.4×104，2.4×103，2.4×102，2.4×101 CFU/mL)；
E.大肠杆菌引物敏感性(1～8.2.6×108，2.6×107，2.6×106，2.6×105，2.6×104，2.6×103，2.6×102，2.6×101 CFU/mL)；
F.马链球菌引物敏感性(1～4.1.2×108，1.2×107，1.2×106，1.2×105 CFU/mL)；
M.DL2000 DNA Marker

M.DL2000 DNA Marker;1～8.1.2×108，1.2×107，1.2×106，1.2×105，1.2×104，1.2×103，1.2×102，1.2×101 CFU/mL

2.5 多重PCR优化反应条件的结果对多重PCR的反应条件进行优化，退火温度59.4℃时，3种目的产物都能得到较好的扩增，因此选择59.4℃作为多重PCR的最佳退火温度(图4A)。在40 μL的多重PCR反应体系中，3种病原菌DNA模板各1 μL，金黄色葡萄球菌上、下游引物各为0.5 μL、大肠杆菌上、下游引物各为0.5 μL、马链球菌上、下游引物各为1 μL，双蒸水13 μL时各目的产物都能得到较好的扩增(图4B)。

A.多重PCR退火温度的确定(M.DL2000 DNA Marker;1～8.分别为60.0，59.4，58.4，56.9，55.1，53.5，52.5，52.0℃)；
B.多重PCR最佳引物质量浓度的确定(M.DL2000 DNA Marker;1～8.分别为0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 μL)

2.6 多重PCR检测方法临床效果评价对采集到的25份子宫内膜炎冲洗液样本进行检测，结果显示，金黄色葡萄球菌阳性率为16.0%，大肠杆菌阳性率为40.0%，马链球菌阳性率为56.0%，大肠杆菌和马链球菌的混合感染阳性率为24.0%(图5)。建立的多重PCR检测方法和单一PCR检测方法的符合率为100%，且在病原菌的检出率上高于传统的分离鉴定方法(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；
1,8,10.金黄色葡萄球菌；
3,5,7.大肠杆菌；
12～15.马链球菌；
4,6,9,16,17.大肠杆菌+马链球菌

表2 多重PCR检测临床样品结果对比 份

在国外的研究调查中，马子宫内膜炎是仅次于胃肠疾病及呼吸道疾病的重要疾病。该病大多发生于妊娠后，如治疗不及时会引起细菌性子宫炎，而细菌性子宫内膜炎对马饲养业造成严重损失，约25%～60%不育母马均患此病[11-12]。

研究报道马子宫内膜炎的主要治疗方式是运用催产素促进子宫积液排出，用无菌等渗盐水进行子宫冲洗，使用抗生素进行子宫内给药或全身治疗[13]。目前，国内对马子宫内膜炎诊断与治疗的相关报道较少，李会颖等[14]对马慢性子宫内膜炎运用抗生素治疗；
霍成新[15]采用0.2%高锰酸钾溶液冲洗子宫，取得一定的治疗效果。王德超等[16]运用中草药方剂治疗马子宫内膜炎，发现中草药方剂能促进子宫收缩，促进子宫积液排出。但在病原菌的检测上依然是靠传统的细菌分离培养、革兰染色、镜检结合生化鉴定等方法进行检测。多重PCR与传统分离培养相比具有良好的灵敏度、特异性以及高通量检测等诸多优点。韩金辉[17]运用多重PCR方法成功检测出引起藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；
王宁宁等[18]运用多重PCR方法成功检测出奶牛子宫内膜炎中的大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、乳房链球菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。

本研究分离出马子宫内膜炎的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌，这与PISELLO等[4]的报道基本一致，但是未发现铜绿假单胞菌，这可能与山丹县所处地理位置有关。山丹县位于河西走廊，环境干燥，而铜绿单胞菌生长需要潮湿环境。建立的多重PCR方法中金黄色葡萄球菌最低检测浓度为2.4×102CFU/mL；
大肠杆菌最低检测浓度为2.6×103CFU/mL；
马链球菌最低检测浓度为1.2×102CFU/mL。本试验的敏感性结果与王爽[19]建立的PCR检测方法结果相似。有研究表明，目的基因的选择会直接影响多重PCR检测方法的可靠性和真实性，应该选取高度保守的基因片段，遵循高特异性、低同源性原则才能保证单一PCR和多重PCR扩增的特异性及敏感性[20]。本研究建立的多重PCR检测结果与肺炎球菌和无乳链球菌无交叉反应，各引物之间均无交叉反应，表明该检测方法具有良好的特异性。运用建立的多重PCR方法对采集到的25份病料进行检测，结果显示金黄色葡萄球菌阳性率为16.0%，大肠杆菌阳性率为40.0%，马链球菌阳性率为56.0%，大肠杆菌和马链球菌的混合感染阳性率为24.0%，其中马链球菌的检测阳性率高于常规的分离方法，原因可能是在用传统的细菌培养鉴定方法时，部分样本中优势细菌的过度繁殖抑制了劣势细菌的生长，影响了分离鉴定的结果。

本研究成功分离鉴定了甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌，且成功建立针对这3种主要病原菌的多重PCR检测方法，该检测方法有较高的特异性和敏感性，在检测率上高于传统病原菌的分离鉴定。因此该方法具有一定的实用价值，为马子宫内膜炎的快速临床诊断提供技术支持。

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