TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

叶苗苗，孙 楠，李奇兵，石文军，王 波，王广文，姜 丽，陈化兰，李呈军

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150069）

流感病毒作为一种重要的人畜共患病毒，在感染人畜后常引起上呼吸系统疾病，具有季节性和地方性流行的特征，且存在禽流感病毒（Avian influen⁃za virus，AIV）跨物种感染人的病例，因此对人畜健康和养禽业经济发展造成重大威胁。该病毒属于正粘病毒科流感病毒属，根据其核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）抗原性的不同，分为A（甲）、B（乙）、C（丙）、D 4 型[1]。此外，基于病毒表面抗原HA 和NA的抗原特性，可以将流感病毒分为H 亚型和N 亚型，迄今为止，已发现至少18 个HA 亚型和11 个NA亚型[2]。流感病毒粒子表面有囊膜，呈多形性，含8个编码病毒蛋白的单股负链RNA 片段，且每个RNA片段都能与一个核蛋白NP 和一个聚合酶组成一个病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）[3]，该结构是流感病毒基因组转录和复制的基本单位。现有的研究表明，流感病毒通过与宿主蛋白形成复杂的互作网络进而对病毒的复制产生正向或负向的选择压力，从而在病毒基因组的复制、病毒粒子的组装以及子代病毒粒子的释放等多个环节发挥重要作用。因此，深入挖掘影响流感病毒复制的宿主依赖因子（Host depen⁃dent factors，HDFs）并阐明其作用机制，将有利于完善宿主与流感病毒间的互作网络，并明确宿主因子参与流感病毒复制周期的阶段，从而为流感的防控与治疗提供理论依据。

三基序（Tripartite motif，TRIM）家族蛋白泛指一类N 端结构域排列高度保守的E3 泛素连接酶，该类蛋白N 端包含RING-B-box-coiled-coil 结构域，又称RBCC 结构域；
C 端包含高度可变的结构域，是每种TRIM 蛋白的特异性标志[4]。TRIM 家族蛋白存在于所有真核生物体内，且其数量与物种等级密切相关。研究表明，苍蝇基因组编码约10种TRIM蛋白，猪基因组编码约57 种TRIM 蛋白，而人类基因组编码超过80 种TRIM 蛋白，这些蛋白广泛参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症反应等生命活动的调控[4-5]。近年来，TRIM 家族蛋白在抗病毒和先天免疫信号调节中发挥作用的研究成为热点，已有研究发现部分TRIM 家族蛋白以不同的方式调控流感病毒的复制，如TRIM22能够通过与流感病毒核蛋白NP 的互作使NP 发生泛素化降解从而抑制流感病毒的复制[6]；
TRIM14 可以有效阻断核蛋白NP 从细胞质易位到细胞核，从而抑制流感病毒在宿主细胞中的传播[7]；
TRIM35 通过激活肿瘤坏死因子受体相关因子3（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3）以及降解流感病毒PB2 蛋白负调控流感病毒的复制[8]。

TRIM74 是TRIM 家族蛋白中的成员，目前尚无TRIM74 与病毒、TRIM74 与宿主天然免疫反应相关的研究报道，其功能尚待探究。根据TRIM74 C 端的可变区，将其划分至TRIM 家族第Ⅴ-2 亚类，与TRIM74 同处于该亚类的TRIM 家族蛋白有TRIM31、TRIM40、TRIM56，对这几个TRIM 蛋白的研究较广泛，并且它们分别靶向宿主先天性免疫反应信号通路中的不同接头分子[9-11]，其中TRIM56 可以通过阻碍病毒RNA 的合成进而抑制甲型和乙型流感病毒的复制[12]。TRIM74 是否与处于同一亚类的上述TRIM 具有相似功能尚不清楚。因此，本研究通过siRNA 干扰TRIM74 的表达；
同时通过慢病毒包装过表达系统构建表达TRIM74 的细胞系，分别利用该细胞系及转染TRIM74 表达质粒上调TRIM74 的表达，探究TRIM74蛋白对流感病毒复制及干扰素信号通路的影响，为进一步了解TRIM74 蛋白的功能提供数据参考。

1.1 病毒、细胞及质粒AIV A/WSN/1933（H1N1）株（以下简称WSN 株）、仙台病毒（SeV）、干扰素刺激反应原件（ISRE）启动子荧光素酶报告质粒pISRELuc 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存；
IFN-β 启动子荧光素酶报告质粒pIFN-β-Luc 购自Addgene 公司；
人非小细胞肺癌细胞（A549）购自ATCC 公司；
人胚胎肾细胞（HEK293T）和犬肾传代细胞（MDCK）、pCDNA3.1 载体、pCDNA3.1-TRIM74-V5 表达质粒（简称pTRIM74-V5）、海参荧光素酶质粒pRL-TK、慢病毒过表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1（简称pLVX）以及辅助质粒pASPI2、pMDG2 均由本实验室保存。

1.2 抗体及主要试剂poly(I:C)购自Invivogen 公司，终浓度为0.5 μg/mL；
兔抗V5单克隆抗体（MAb）购自Millipore 公司；
兔抗GAPDH MAb 和鼠抗TRIM74 MAb购自Proteintech公司；
Alexa FluorTM488 兔抗小鼠IgG（H+L）（A21206）购 自Thermo Fisher 公 司；
Dy⁃Light800 山羊抗鼠IgG 和DyLight680 山羊抗兔IgG 购自KPL 公司；
Lipofectamine 2000 转染试剂、RNAi Max 转染试剂购自Invitrogen 公司；
5×SDS 蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript®RII Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）购自Vazyme 公司；
Opti-MEM 培养基、10×MEM 培养基均购自Gibco 公司；
F-12K 培养基购自WISENT 公司；
DMEM 培养基购自Sigma 公司；
RNA 提取试剂盒购自TIANGEN 公司；
细胞活力检测试剂盒Cell Titer-Glo kit、双荧光素酶检测试剂盒购自Promega 公司。

1.3 引物及siRNA的设计与合成根据NCBI中TRIM74基因序列（378108），设计并合成靶向TRIM74 的特异性siRNA 以及阴性对照NC siRNA，序列见表1。根据NCBI 中人源IFNB1 基因（3456）、ISG56 基因（3434）、TRIM74 基因（378108）序列，利用Primer Premier 6.0软件设计合成相应的荧光定量PCR（qPCR）引物及TRIM74 扩增引物（表1）。siRNA 由上海吉玛基因公司设计并合成，qPCR 引物及克隆引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

1.4 siRNA 干扰TRIM74 的表达对流感病毒复制影响的检测

1.4.1 TRⅠM74 siRNA干扰效率的qPCR检测 将siTRIM74-331和阴性对照NC siRNA 各取30 pmol（1.5 μL），利用RNAiMAX 转染试剂分别转染A549 细胞，置于37 ℃、5% CO2培养48 h 后用Buffer RZ 裂解细胞，收获细胞样品并提取细胞总RNA，反转录为cDNA 后作为模板，利用表1中的hTRIM74-qPCR引物经qPCR检测TRIM74的转录水平，以GAPDH作为内参校准，以2-ΔΔCt法分析数据结果。

表1 siRNA及引物序列Table 1 siRNA and primers sequences

1.4.2 siRNA 干扰TRⅠM74 的表达后对细胞活力影响的检测 按1.4.1 中的方法将siTRIM74-331 和NC siR⁃NA 分别转染A549 细胞，并将细胞铺于透光的96 孔细胞培养板内，置于37 ℃、5% CO2培养。48 h 后利用细胞活力检测试剂盒检测干扰TRIM74 的表达对细胞活力的影响。

1.4.3 siRNA 干扰TRⅠM74 的表达后对流感病毒复制影响的噬斑滴定检测 按照1.4.1 中的方法将si⁃TRIM74-331 和NC siRNA 分别转染A549 细胞，置于37 ℃、5% CO2培养。48 h 时，将AIV WSN 株以MOI 0.01 感染细胞，分别于感染后24 h、48 h 收集细胞上清，采用文献中病毒噬斑滴定方法[13]，检测干扰TRIM74 的表达对流感病毒复制的影响。

1.5 过表达TRIM74 对流感病毒复制影响的检测

1.5.1 TRⅠM74 过表达细胞系的构建与鉴定 提取A549 细胞总RNA 并反转录为cDNA 作为模板，利用表1 中的TRIM74-pLVX 引物对经PCR 扩增TRIM74 基因，并将其克隆至慢病毒过表达载体pLVX 中，构建pLVX-TRIM74 质粒。经测序比对鉴定正确后，将pLVX-TRIM74 和 辅 助 质 粒pASPI2、pMDG2 共 转 染HEK293T 细胞包装成慢病毒，同时转染pLVX 空载体和辅助质粒作为对照。48 h 后收集慢病毒侵染A549细胞，12 h 后补加含10% FBS 的F-12K 培养基继续培养，48 h 后再利用流式细胞术分选绿色荧光强度高的细胞，经过多次传代培养，获得过表达TRIM74基因的细胞系（A549-pLVX-TRIM74）以及对照细胞（A549-pLVX）[14]。分别提取上述两种细胞总RNA 反转录为cDNA 后作为模板，经1.4.1 中的qPCR 鉴定这两种细胞系；
取相同数目的该两种细胞，经1×SDS蛋白上样缓冲液裂解后，分别以鼠抗TRIM74 MAb（1∶1 000）、兔抗GAPDH MAb（1∶1 000）作为一抗，DyLight680 山羊抗兔IgG（1∶10 000）和DyLight800 山羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，经western blot 鉴定这两种细胞中TRIM74 蛋白的表达。

1.5.2 过表达TRⅠM74对流感病毒复制影响的噬斑滴定检测 将A549-pLVX-TRIM74细胞和对照A549-pLVX细胞分别铺于12 孔板，待细胞密度为80%时，将WSN 株以MOI 0.01 感染细胞，分别于感染后24 h、48 h 收集细胞上清，按照1.4.3 的方法进行噬斑滴定，检测过表达TRIM74 对流感病毒复制的影响。

1.6 流感病毒感染对宿主细胞内源TRIM74 mRNA转录水平及其蛋白表达影响的检测

1.6.1 流感病毒感染对内源TRⅠM74 mRNA 转录水平影响的qPCR 检测 将A549 细胞和HEK293T 细胞分别铺于12 孔板，待细胞长满单层后，将WSN 株以MOI 5 分别感染上述两种细胞，分别于感染后0、3 h、6 h 和9 h 收获细胞样品并提取细胞总RNA，反转录为cDNA 作为模板，利用表1 中的hTRIM74-qP⁃CR、GAPDH-qPCR 引物，经qPCR 检测内源TRIM74 mRNA 的转录水平。

1.6.2 流感病毒感染对内源TRⅠM74 蛋白表达影响的western blot 检测 将WSN 株以MOI 5 分别感染12 孔板中长满单层的A549 细胞和HEK293T 细胞，设未感染病毒的细胞为阴性对照，37 ℃培养9 h 后裂解细胞，按照1.5.1 中的western blot 方法检测上述两种细胞中内源TRIM74 蛋白的表达水平。

1.7 过表达TRIM74对相应干扰素分泌水平影响的检测

1.7.1 过表达TRⅠM74 对细胞中ⅠFN-β 和ⅠSRE 启动子活性影响的双荧光素酶试验 将pTRIM74-V5表达质粒以不同剂量（0、50 ng、100 ng、200 ng）分别转染HEK293T 细胞，24 h 后裂解细胞，取裂解液经SDS-PAGE 电泳后，分别以兔抗V5 MAb（1∶1 000）、兔抗GAPDH MAb（1∶1 000）为一抗，以DyLight680 山羊抗兔IgG（1∶10 000）为二抗，经western blot 检测TRIM74 的过表达。在确定TRIM74 呈剂量依赖性过表达后，将本实验分为两组：将上述不同剂量的pTRIM74-V5 表达质粒及pCDNA3.1 空载体（阴性对照）分别与pRL-TK、pIFN-β-Luc 报告质粒共转染HEK293T 细胞（1 组）；
另一组将上述不同剂量的pTRIM74-V5表达质粒及pCDNA3.1空载体（阴性对照）分别与pRL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞（2 组）。37 ℃培养24 h后分别以SeV（MOI 1）感染上述各组细胞，感染12 h后裂解细胞，10 000 r/min，室温离心10 min 后，取20 μL 上清加入96 孔板，利用GloMax 96 Microplate Luminometer 生物化学发光仪检测各组细胞的双荧光素酶活性，分析过表达TRIM74对IFN-β 和ISRE 启动子活性的影响。所有实验组至少重复检测3 次。

1.7.2 过表达TRⅠM74 对ⅠFN-β 和ⅠSG56 mRNA 转录水平影响的qPCR 检测 将pTRIM74-V5 表达质粒转染HEK293T 细胞，同时以转染pCDNA3.1 空载体的细胞作为阴性对照，24 h 后分别采用SeV 和poly(I:C)刺激细胞，并分别设未经SeV 和poly(I:C)刺激的上述各组细胞作为Mock 组。12 h 后收获细胞提取细胞总RNA，反转录为cDNA 作为模板，采用表1 中的引物hIFNB1-qPCR、hISG56-qPCR 和GAPDH-qPCR，经qPCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56的转录水平。

1.8 干扰TRIM74 表达对相应干扰素分泌水平影响的qPCR 检测分别将siTRIM74-331 和阴性对照NC siRNA 转染HEK293T 细胞，24 h 后，分别将pRLTK+pIFN-β-Luc 报告质粒和pRL-TK+pISRE-Luc 报告质粒转染上述各组细胞，24 h 后分别采用SeV 和poly(I:C)刺激细胞，并分别设未经SeV 和poly(I:C)刺激的上述各组细胞作为Mock 组。12 h 后，采用1.7.2 中的qPCR 方法分别检测上述细胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的转录水平。

1.9 数据的统计与分析所有数据均采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，以t检验比较各组间的差异。ns表示P＞0.05，差异不显著；
*表示P＜0.05，差异显著；
**表示P＜0.01、***表示P＜0.001、****表示P＜0.0001，差异均极显著。

2.1 siRNA 干扰TRIM74 的表达对流感病毒复制影响的检测结果将siTRIM74-331 与对照NC siRNA 分别转染A549 细胞后，经qPCR 检测siTRIM74-331 的干扰效率，并利用细胞活力检测试剂盒检测干扰TRIM74 的表达对细胞活力的影响。结果显示，与转染对照NC siRNA 的细胞相比，转染siTRIM74-331 的A549 细胞中TRIM74 mRNA 的转录水平下降了62.70%（P＜0.0001）（图1A），但不影响细胞活力（P＞0.05）（图1B），表明siTRIM74-331 干扰效果较好，可以用于后续试验。将siTRIM74-331 与对照NC siRNA 分别转染A549 细胞，48 h 后用WSN（MOI 0.01）感染细胞，分别于感染后24 h和48 h收获上清进行噬斑滴定，结果显示，与转染NC siRNA 的对照组相比，干扰TRIM74 的表达再感染WSN 株24 h、48 h 后细胞中的病毒滴度分别下降5.21%和61.19%（P＜0.001）（图1C），表明下调TRIM74 的表达可以抑制流感病毒的复制。

图1 siRNA干扰TRIM74的表达对流感病毒复制影响的检测结果Fig.1 The results of the effect of siRNA interference with the expression of TRIM74 on influenza virus replication

2.2 过表达TRIM74 对流感病毒复制影响的检测结果构建的重组质粒pLVX-TRIM74 经测序鉴定正确后与辅助质粒共转染HEK293T 细胞包装成慢病毒，48 h 后收获慢病毒侵染A549 细胞，48 h 后利用流式细胞术分选阳性细胞，多次传代后，通过qPCR 和western blot 鉴定获得的细胞。结果显示，该细胞中TRIM74 基因的转录水平及其蛋白的表达水平较转染空载体及相应辅助质粒获得的对照细胞均明显升高（图2A、图2B），表明TRIM74 基因过表达细胞A549-pLVX-TRIM74 以及对照细胞A549-pLVX 均正确构建。将WSN（MOI 0.01）分别感染这两种细胞，感染后24 h、48 h 分别收集上清经病毒的噬斑滴定。结果显示，A549-pLVX-TRIM74 细胞中的病毒滴度分别为9.13×105pfu/mL 与2.03×106pfu/mL，对照细胞相应时间的病毒滴度分别为4.73×105pfu/mL 与1.07×106pfu/mL，前者相较后者分别上升了1.93 倍（P＜0.01）和1.90 倍（P＜0.05）（图2C），表明过表达TRIM74 蛋白可以促进流感病毒的复制。

图2 过表达TRIM74对流感病毒复制影响的检测结果Fig.2 The results of the effect on influenza virus replication by overexpression of TRIM74

2.3 流感病毒感染对细胞中内源TRIM74 mRNA 的转录水平及其蛋白表达影响的检测结果将WSN 株（MOI 5）分别感染A549 细胞和HEK293T 细胞后，分别利用qPCR（感染后不同时间）和western blot（感染后9 h）检测内源TRIM74 mRNA 的转录水平及其蛋白的表达水平。结果显示，与未感染的对照细胞相比，流感病毒感染后的A549 细胞和HEK293T 细胞中TRIM74 mRNA 的转录水平随感染时间的延长而增加（P＜0.001、P＜0.01）（图3A、图3C）；
其蛋白表达水平也均明显增加（图3B、图3D），表明流感病毒感染会刺激细胞中内源TRIM74 蛋白的表达，推测细胞可能通过上调TRIM74 蛋白的表达以某种方式响应流感病毒的感染。

图3 流感病毒感染对细胞中内源TRIM74的转录水平及其蛋白表达影响的检测结果Fig.3 Detection results of the effect of influenza virus infection on the transcription level of endogenous TRIM74 and its protein expression in cells

2.4 过表达TRIM74 对干扰素分泌水平影响的检测结果

2.4.1 过表达TRⅠM74 对细胞中ⅠFN-β 和ⅠSRE 启动子活性影响的双荧光素酶试验结果 将不同剂量的pTRIM74-V5 转染HEK293T 细胞，24 h 后，经western blot 检测TRIM74 的过表达。结果显示，TRIM74 在细胞中的表达量呈剂量依赖性的增加（图4A）。将上述剂量的pTRIM74-V5 与pRL-TK、pIFN-β-Luc 共转染HEK293T细胞（1组）；
同时将上述剂量的pTRIM74-V5 与pRL-TK、pISRE-Luc 共 转 染HEK293T 细 胞（2组）。24 h后用SeV（MOI 1）感染上述细胞，12 h后采用双荧光素酶试剂盒检测双荧光素酶活性，分析过表达TRIM74 对IFN-β 和ISRE 启动子活性的影响。结果显示，转染空载体的对照细胞在感染SeV后IFNβ 和ISRE 启动子被显著激活，而1 组和2 组细胞中IFN-β 和ISRE 启动子的活性均显著下降（P＜0.0001、P＜0.0001），且随pTRIM74-V5 转染量的升高二者的活性均呈下降趋势（图4B、图4C）。表明过表达TRIM74 能够抑制SeV 诱导的IFN-β 和ISRE 启动子的激活作用。

图4 过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性影响的双荧光素酶试验结果Fig.4 The results of the effect on IFN-β and ISRE promoter activities detected by dual-luciferase assay in over-expressing TRIM74 cells

2.4.2 过表达TRⅠM74 对ⅠFN-β 和ⅠSG56 转录水平影响的qPCR 检测结果 将pTRIM74-V5 转染HEK293T细胞，24 h 后分别采用SeV 和poly(I:C)刺激细胞，12 h 后采用qPCR 分别检测各组细胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的转录水平。结果显示，SeV 和poly(I:C)刺激后的各组细胞中IFN-β mRNA 的转录水平均显著高于Mock 组细胞，且转染pTRIM74-V5 细胞中IFN-β 的转录水平均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞（P＜0.01、P＜0.001）（图5A、图5B）；
各组细胞中ISG56 mRNA 的转录水平与上述结果均一致（P＜0.0001、P＜0.01）（图5C、图5D）。上述结果表明，过表达TRIM74 能够抑制相应干扰素基因的转录水平。

图5 过表达TRIM74对IFN-β和ISG56转录水平影响的qPCR检测结果Fig.5 qPCR detections of the effect on IFN-β and ISG56 transcription level by over-expressing TRIM74

2.5 干扰TRIM74 的表达对IFN-β和ISG56 转录水平影响的qPCR 检测结果将siTRIM74-331 与对照NC siRNA 分别转染HEK293T 细胞，48 h 后分别采用SeV 和poly(I:C)刺激细胞，12 h 后经qPCR 检测IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平。结果显示，与Mock组细胞相比，SeV和poly(I:C)刺激后的各组细胞中IFN-β和ISG56 的mRNA 水平均显著升高，且转染siTRIM74-331 细胞中IFN-β 的转录水平均显著高于转染空载体的阴性对照细胞（P＜0.0001、P＜0.0001）（图6A、图6B）；
各组细胞中ISG56 mRNA 的转录水平与上述结果均一致（P＜0.05、P＜0.0001）（图6C、图6D），表明下调表达TRIM74 显著促进相应干扰素基因的转录水平。结合2.4 的结果表明，TRIM74 能够负调控细胞中相应干扰素的分泌水平。

图6 siRNA干扰TRIM74的表达对IFN-β和ISG56转录水平影响的qPCR检测结果Fig.6 qPCR detections of the effect on IFN-β and ISG56 transcription level by silencing the expression of TRIM74 with siRNA

流感的控制策略依赖于疫苗接种，但流感病毒亚型众多、变异迅速，需要及时更新疫苗种毒[15]，且目前的抗病毒药物如金刚烷胺等也正在失去效力[16]。因此，迫切需要探究AIV 新的抗病毒机制，并基于这些机制开发新的治疗药物。根据流感病毒复制所需的宿主依赖因子（HDF）的特性设计药物或小分子抑制剂干预HDF 的促病毒复制功能，可有效对抗流感病毒并最大限度地减少耐药病毒株的出现。

TRIM 家族蛋白含有保守的RING-B-box-coiledcoil 结构域，并广泛参与细胞的生物学过程，且部分TRIM 能够调节宿主细胞的先天免疫反应，并参与其对病原的识别及免疫信号传导过程[17]。目前关于TRIM74 蛋白尚无相关研究报道，其蛋白功能有待探究。因此，本研究对TRIM74 是否参与宿主的抗流感病毒感染及其天然免疫调节进行了初步探究。

本研究采用噬斑滴定试验证明siRNA 干扰TRIM74 的表达后能够抑制流感病毒的复制。由于重组质粒在流感病毒靶细胞A549 中的转染效率低，所以本研究构建了TRIM74 蛋白的过表达细胞A549-pLVX-TRIM74 和对照细胞A549-pLVX，并进一步通过噬斑滴定试验证明过表达TRIM74 能够促进流感病毒的复制，表明TRIM74 为流感病毒复制的HDF。本研究采用qPCR 及western blot 证实流感病毒感染细胞后会刺激细胞内源TRIM74 的转录及表达，推测宿主细胞可能通过增加TRIM74 的表达并以某种方式参与调控流感病毒的复制。

相关研究表明I 型干扰素和III 型干扰素在宿主抗病毒感染的先天性免疫反应中发挥重要作用[18]，流感病毒侵入宿主细胞后，病毒RNA 能够被宿主细胞内视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别并使其发生构象变化从而释放其N 端的半胱天冬酶激活和募集结构域（CARDs）[19]，进而招募线粒体抗病毒接头蛋白（MAVS）启动宿主的天然免疫信号传导，从而诱导干扰素的分泌[20]。经诱导产生的干扰素通过与宿主细胞不同受体结合后激发不同的信号转导通路，进而刺激下游效应蛋白的产生，通过这些效应蛋白最终发挥抗病毒作用[21]。因此，本研究探究了TRIM74 对细胞中相关干扰素分泌水平的影响。本研究将常用于刺激宿主细胞IFN-β 和ISRE 启动子活性的SeV、poly(I:C)作为刺激物刺激过表达TRIM74的细胞后，分别利用双荧光素酶活性试验和qPCR检测细胞中IFN-β和ISRE 启动子活性及其mRNA 的转录水平。结果显示，过表达TRIM74 能够抑制SeV 和poly(I:C)诱导的IFN-β 和IRES 启动子的激活及二者mRNA 的转录水平。本研究又通过siRNA 干扰细胞中TRIM74 的表达后，分别利用SeV 和poly(I:C)刺激细胞，再经qPCR 检测细胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的转录水平，结果显示，干扰TRIM74的表达促进二者mRNA的转录水平。上述结果表明，TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌水平。由此推测，流感病毒感染细胞后刺激内源TRIM74表达的增加，表达的TRIM74通过抑制干扰素的生成导致干扰素介导的信号通路下游效应蛋白表达的降低，从而有利于流感病毒在宿主细胞中的复制，其具体机制有待后续深入挖掘。

此外，TRIM74 具有保守的指环（RING）结构域，一般认为RING 结构域具有E3泛素连接酶活性，通过与相关的E2泛素结合酶共同作用于靶蛋白并对靶蛋白进行泛素化修饰，从而发挥其抗病毒功能[22]。但目前对TRIM74蛋白功能的研究很少，TRIM74是否依赖于其E3泛素连接酶活性参与调控流感病毒的复制及宿主的免疫调节尚不清楚。后续将对TRIM74 调控流感病毒复制的具体阶段及其E3 泛素连接酶活性在调控流感病毒复制中的作用做深入研究。本研究为TRIM74蛋白功能的研究和流感的防控提供了参考依据。

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