miR-23b-3p对结直肠癌奥沙利铂化疗敏感性的影响

陈 瑜，王佳琪，王媛媛，冯 稳，张 贺，夏庆欣

郑州大学附属肿瘤医院病理科；
河南省肿瘤病理和人工智能诊断医学重点实验室；
郑州市疑难肿瘤病理精准诊断重点实验室 郑州 450008

在过去几十年里，铂类药物被大量应用于结直肠癌患者的化疗中。作为根治性结直肠癌切除术后一种重要的辅助治疗手段，铂类药物在改善患者预后方面发挥了重要作用[1]，然而仍有部分患者出现对铂类药物的原发性或获得性耐药，最终导致治疗失败[2]。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是第3代铂类抗癌药，它可与DNA形成复合物，通过阻断DNA双链的复制和转录诱导细胞凋亡，是目前临床常用化疗方案的重要组成部分[3]，因此阐明结直肠癌对OXA耐药的分子机制对筛选潜在的治疗靶点和改善结直肠癌治疗效果至关重要。miRNA是一类长度19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，主要通过降解或抑制靶基因表达发挥其生物学功能，是细胞增殖、分化、凋亡、细胞间信号传导、细胞自噬和细胞代谢等生物学过程的调节因子[4]。越来越多的研究[5-7]发现，miRNA异常表达与肿瘤化疗耐药性及患者预后相关。miR-23b-3p能通过抑制自噬相关基因-12和高迁移率族蛋白B2(high mobility group protein B2，HMGB2)介导的自噬增加胃癌细胞的化疗敏感性，其表达异常也与乳腺癌、肝细胞癌的化疗耐药相关；
miR-23b-3p在结直肠癌进展过程中发挥抑癌基因作用[8-10]。本研究检测了miR-23b-3p在化疗耐药结直肠癌患者血清中的表达，并探讨miR-23b-3p对结直肠癌细胞OXA化疗敏感性的影响，为OXA耐药结直肠癌患者的治疗提供新的思路。

1.1 研究对象和试剂选取2017年6月至2019年12月郑州大学附属肿瘤医院收治的结直肠癌患者。纳入标准：①接受结直肠癌根治性手术，术后病理结果确诊为结直肠癌。②术后给予以OXA为基础的同种联合化疗。③临床资料完整，并签署知情同意书。排除标准：①既往罹患其他类型恶性肿瘤并使用过OXA或OXA同种化疗药物。②结直肠癌复发患者。③治疗过程中联合放化疗。④患有严重器质性疾病。根据以上标准共68例患者入选。所有研究对象在接受4～6个疗程治疗后，根据实体瘤评定标准(RECIST 1.0)评价疗效，分为化疗耐药组(n=32)和非耐药组(n=36)。所有研究对象均通过电话或者来院复查方式随访，随访截止时间为2022年1月30日。以死亡为终点事件。

人结直肠癌细胞株SW620和OXA耐药细胞株(SW620/OXA)购自上海通蔚生物科技有限公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，TRIzol试剂、RNA反转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，双荧光素酶报告系统试剂盒购自美国Promega公司，CCK-8试剂盒及OXA购自美国Sigma-Aldrich公司，细胞凋亡检测试剂盒，HMGB2、Bcl-2、Bax、GAPDH兔抗人多克隆抗体及HRP标记二抗均购自上海碧云天生物技术公司，PCR引物、miR-23b-3p mimic、 mimic-NC、miR-23b-3p抑制剂、sh-HMGB2和sh-NC均由上海吉凯基因有限公司提供。

1.2 患者血清、SW620和SW620/OXA细胞中miR-23b-3p表达的测定根据TRIzol说明书分别提取结直肠癌患者治疗前血清、SW620细胞及SW620/OXA细胞总RNA，通过紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度后，将提取的总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行qPCR扩增。miR-23b-3p上游引物序列：
5’-ACACTCCAGCTGGGATCA CATTGCCAGGGAT-3’，下游引物序列：
5’-CT CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGT GGTAAT-3’；

U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3’。反应体系：10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.6 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.2 μg，Taq DNA聚合酶0.2 μL，1.5 mmol/L Mg2+1.5 μL，加ddH2O补足20 μL。反应条件：95 ℃预热10 min；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 20 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-23b-3p的相对表达水平。细胞实验重复3次。

1.3 细胞转染与分组SW620/OXA细胞以5×104个/mL接种于6孔板，每孔200 μL。在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达70%～80%时，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书转染48 h。实验Ⅰ分为空白对照组、miR-23b-3p mimic组、mimic-NC组，实验Ⅱ分为sh-NC组、sh-HMGB2组和sh-HMGB2+miR-23b-3p抑制剂组，分别用于观察过表达miR-23b-3p、抑制HMGB2及同时抑制miR-23b-3p和HMGB2的表达对以下观察指标的影响。

1.4 各组细胞增殖能力及OXA增殖抑制作用的检测收集实验Ⅰ、Ⅱ中各组细胞制备单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，待细胞贴壁后更换含体积分数10%胎牛血清的培养液继续培养24、48和72 h，或者更换含1、5、10、20、40和80 mg/L OXA的培养液继续培养72 h，加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h后应用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值，代表细胞的增殖能力。计算OXA对SW620/OXA细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次。

1.5 各组细胞凋亡的检测收集实验Ⅰ、Ⅱ中各组细胞，胰蛋白酶消化后2 500 r/min离心5 min，取细胞沉淀，PBS洗涤两次后用体积分数70%乙醇4 ℃固定16 h，离心弃去固定液，调整细胞密度为105个/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室温避光反应5～10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.6 各组细胞Bcl-2、Bax及HMGB2蛋白表达水平的检测收集实验Ⅰ、Ⅱ中各组细胞，提取细胞总蛋白，定量后取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，然后将蛋白转移到PVDF膜上，100 g/L脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h，TBST洗膜后，加入Bcl-2(1∶600稀释)、Bax(1∶600稀释)、HMGB2(1∶400稀释，仅实验Ⅱ中各组细胞)和GAPDH(1∶1 000稀释)一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后，加入1∶1 000稀释的羊抗兔二抗室温孵育1 h，将PVDF膜浸于显色液中避光约10 min后观察结果，用凝胶图像处理系统分析目的条带相对于GAPDH条带灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.7 双荧光素酶报告实验Targetscan(http://www.targetscan.org)在线靶基因预测软件预测miR-23b-3p与HMGB2间存在靶向结合位点。将SW620/OXA细胞以1×104个/孔接种于12孔板，当细胞融合度达80%时，参照转染说明书，将WT-HMGB2或MUT-HMGB2重组报告载体与miR-128-3p mimic或mimic-NC分别转染SW620/OXA细胞。转染48 h后，按照双荧光素酶报告系统试剂盒说明书计算相对荧光素酶活性。实验重复3次。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学分析。采用χ2检验或两独立样本t检验比较耐药组和非耐药组基线资料的差异。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线， Log-rank法比较两组患者生存曲线的差异。采用两独立样本t检验比较耐药组和非耐药组、SW620和SW620/OXA细胞中miR-23b-3p表达水平的差异。采用单因素方差分析和LSD-t检验比较实验Ⅰ和实验Ⅱ各组细胞增殖能力、IC50、凋亡率及Bcl-2、Bax、HMGB2蛋白表达水平的差异。检验水准α= 0.05。

2.1 耐药组和非耐药组基线资料及患者血清、SW620和SW620/OXA细胞中miR-23b-3p表达水平的比较耐药组和非耐药组基线资料比较见表1。由表1可知，2组间除分化程度和远处转移外，其他指标差异均无统计学意义。

与非耐药组(0.76±0.05)相比，耐药组血清miR-23b-3p的表达水平(0.59±0.04)显著下降(t=3.040，P=0.003)；
与SW620细胞(0.79±0.06)相比，SW620/OXA细胞中miR-23b-3p的表达水平(0.43±0.08)亦显著下降(t=3.453，P=0.026)。

2.2 不同miR-23b-3p表达水平的结直肠癌患者生存情况的比较根据miR-23b-3p表达水平中位数(0.67)将结直肠癌患者分为miR-23b-3p低表达组和miR-23b-3p高表达组。68例结直肠癌患者的随访时间中位数(上、下四分位数)为34(11，54)个月，Kaplan-Meier分析结果显示，miR-23b-3p高、低表达组的生存曲线(图1)差异有统计学意义(χ2=13.505，P<0.001)，高表达组的生存率高于低表达组。

2.3 过表达miR-23b-3p对SW620/OXA细胞增殖、化疗敏感性及细胞凋亡的影响qPCR结果显示，miR-23b-3p mimic组SW620/OXA细胞miR-23b-3p相对表达水平为(1.63±0.05)，较mimic-NC组(1.04±0.07)和空白对照组(1.02±0.09)显著升高(F=21.820，P=0.002)，表明细胞转染成功。

CCK-8实验和细胞毒性实验表明，miR-23b-3p mimic组SW620/OXA细胞的增殖能力、OXA的IC50低于mimic-NC组和空白对照组，即过表达miR-23b-3p可增强SW620/OXA细胞对OXA的化疗敏感性。结果见表2。

表1 2组患者基线资料比较

图1 miR-23b-3p高、低表达组的生存曲线

表2 各组细胞增殖能力及IC50的比较(n=3)

双染法和Western blot结果显示，miR-23b-3p mimic组SW620/OXA细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平均高于mimic-NC组和空白对照组，Bcl-2蛋白表达水平低于mimic-NC组和空白对照组(P<0.05)，见图2、表3。

1：空白对照组；
2：mimic-NC组；
3：miR-23b-3p mimic组

表3 各组细胞凋亡率和 Bcl-2、Bax蛋白表达水平的比较(n=3)

2.4 miR-23b-3p和HMGB2靶向关系的验证双荧光素酶报告实验结果显示，与mimic-NC组相比，转染miR-23b-3p mimic可显著降低转染WT-HMGB2重组报告载体细胞中的相对荧光素酶活性[(0.57±0.10)vs(1.02±0.08)，t=5.639，P=0.005]，但对转染MUT-HMGB2重组报告载体的细胞无影响(P>0.05)，初步验证了miR-23b-3p和HMGB2 mRNA的靶向调控关系。

2.5 抑制HMGB2或同时抑制miR-23b-3p和HMGB2的表达对SW620/OXA细胞增殖、化疗敏感性及细胞凋亡的影响qPCR结果显示，sh-HMGB2组HMGB2 mRNA相对表达水平为(0.34±0.06)，较sh-NC组(1.04±0.08)降低(t=7.069，P=0.001)，表明细胞转染成功；
与sh-HMGB2组相比，sh-HMGB2+miR-23b-3p抑制剂组HMGB2 mRNA相对表达水平(0.83±0.04)升高(t=6.407，P=0.003)，表明抑制miR-23b-3p的表达可上调HMGB2 mRNA的表达。

CCK-8实验和细胞毒性实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-HMGB2组细胞增殖能力减弱，IC50降低；
而与sh-HMGB2组相比，sh-HMGB2+miR-23b-3p抑制剂组细胞增殖能力增强，且IC50升高，提示细胞对OXA的化疗敏感性减弱。见表4。

表4 各组细胞增殖能力及IC50的比较(n=3)

与sh-NC组相比，sh-HMGB2组HMGB2蛋白表达水平降低，细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低；
与sh-HMGB2组相比，sh-HMGB2+miR-23b-3p抑制剂组HMGB2蛋白表达水平升高，细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，见图3、表5。

1：sh-NC组；
2：sh-HMGB2组；
3：sh-HMGB2+miR-23b-3p抑制剂组

表5 各组细胞HMGB2、Bcl-2、 Bax蛋白相对表达水平及细胞凋亡率的比较(n=3)

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率均位于全球恶性肿瘤前列，每年约有220万新增确诊患者和110万新增死亡患者[11-12]。结直肠癌发病隐匿，多数患者确诊时病程已进展至中晚期，采用手术治疗结合辅助化疗方案能在一定程度上改善患者预后，但5 a生存率仍不足25%，其主要原因在于结肠癌细胞具有多重耐药的特点[13]，因此，探索结直肠癌化疗耐药的关键分子和生物标志物对于寻找有效的结直肠癌治疗策略具有重要意义。

miRNA是一类小分子非编码RNA，与细胞增殖、凋亡、分化等过程密切相关。研究发现，部分miRNA异常表达参与调节恶性肿瘤细胞的化疗耐药性，如李志发等[14]研究发现，miR-490-3p在化疗耐药结直肠癌患者外周血中表达水平升高，其通过调控Smad2/TGF-β信号通路增强结直肠癌细胞对OXA的化疗敏感性；
Hua等[15]研究发现硫酸类肝素蛋白多糖2在5-FU耐药结直肠癌细胞中高表达，miR-20b-5p可靶向调节硫酸类肝素蛋白多糖2表达，通过JNK/ERK信号通路恢复结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性。此外，Wang等[16]研究发现miR-135b-3p通过调控MUL1/ULK1信号通路介导肿瘤细胞发生保护性自噬程序，促进结直肠癌细胞对OXA产生耐药。由此可见，研究miRNA在结直肠癌化疗耐药中的作用机制十分必要。

以往研究[17]发现miR-23b-3p在结直肠癌组织和细胞中低表达，其通过调控非染色体结构维护亚基凝聚素Ⅰ复合物亚基G蛋白和PI3K/AKT信号通路抑制肿瘤细胞增殖，并促进凋亡；
另外，lncRNA UCA1通过调控miR-23b-3p/ZNF281分子轴介导了结直肠癌细胞对5-FU的耐药[18]。本研究结果显示，miR-23b-3p在实施OXA同种联合化疗并产生耐药的结直肠癌患者的外周血中低表达，miR-23b-3p高表达患者的术后生存率显著高于低表达患者，提示miR-23b-3p对结直肠癌化疗有一定研究价值。为此，本研究选取人结直肠癌细胞株SW620和OXA耐药细胞株SW620/OXA进行研究，发现SW620/OXA细胞株miR-23b-3p水平亦明显低于SW620细胞株。进一步研究发现，过表达miR-23b-3p可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，细胞内Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，同时可降低OXA对结直肠癌细胞的IC50值，提示可增强结直肠癌细胞对OXA的化疗敏感性。

HMGB2是一种高度保守的核蛋白，其作为染色质结合因子能促进转录因子与其对应靶点的结合。近年来研究发现HMGB2异常表达参与多种恶性肿瘤的发生、发展及化疗耐药过程，如刘爱蕙等[19]报道，沉默HMGB2表达可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭及迁移过程，并促进细胞凋亡；
Kwon等[20]报道HMGB2是影响原发性肝细胞癌患者预后的独立危险因素。本研究通过生物信息学分析和双荧光素酶报告实验证实HMGB2是miR-23b-3p的下游靶基因，沉默HMGB2表达能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，并降低OXA对结直肠癌细胞的IC50，抑制miR-23b-3p同时转染sh-HMGB2则能恢复细胞增殖能力，减少细胞凋亡，增加Bcl-2表达，降低Bax表达，增加OXA的IC50，提示miR-23b-3p可能通过靶向调控HMGB2抑制SW620/OXA细胞增殖并提高其对OXA的化疗敏感性。

综上所述，本研究发现miR-23b-3p在OXA耐药结直肠癌患者血清和耐药结直肠癌细胞中表达下调，miR-23b-3p可靶向调控HMGB2，提高耐药结直肠癌细胞对OXA的化疗敏感性，为结直肠癌耐药患者的治疗提供了新的思路和解决策略。

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