龙眼叶中总黄酮的提取及降血糖机制的研究*

黄淑婷，巫秋霖，莫漫莉，张李江，王华鸣，姜 涛

(珠海科技学院药学与食品科学学院，广东 珠海 519041)

糖尿病在我们生活当中并不少见，出现糖尿病这种病症总结来主要是因为体内的免疫系统功能受到了外部致病因子的侵害，导致机体免疫功能受损。同时在外界存在的微生物感染和遗传因素等，都会给身体健康带来潜在风险。体内的胰岛细胞功能在这些风险因素的影响下出现衰退，胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率进一步下降，具体的症状就是体内的血糖数值增加。

根据有关实验发现抑制身体内消化道生成的α-葡萄糖苷酶的活性，可以控制人体吸收糖类的数量，这样就达到降低血糖的目的[1]。阿卡波糖、伏格列波糖以及米格列醇等都是当前临床上经常使用到的α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGI)，他们具有控制“多糖分解成单糖”这一过程的能力是因为他们能够有效占领α-葡萄糖苷酶与糖的结合位点，从而避免人体过量吸收单糖，这一作用有助于糖尿病患者的血糖数值恢复正常。AGI的优点是吸收少，不会产生全身性的严重副作用，仅有可能因未消化的糖类被细菌反应而引起腹胀、腹泻和腹痛[2-3]。但是现今的研究主要集中在筛选具有广谱作用的抗糖尿病药物，对新型降血糖药物的研发的关注较少，因而需要进一步研究与发展副作用小，同时疗效更佳具有更有疗效的新型AGI。

通常情况下，龙眼叶(DimocarpusLonganLour.)的制作选取龙眼树当中最嫩的树叶部位，龙眼叶的功效为去除邪热或虚热解除病毒，疏解肌表促使发汗等为主要功效。近年来随着科学实验的深入分析，人们在龙眼叶当中发现了更多的化学成分，比如多酚类、黄酮类以及挥发油物质[4-5]。其中黄酮类化合物为其主要活性物质，在这些物质当中，只有黄酮类的化合物可以产生抗氧化的作用，对冠状血管类的疾病具有良好的疗效，具有强化血管，抑制病毒和细菌的作用[6]。并且在这些实验当中也发现了黄酮类物质可以有效的减少血糖的活跃度[7]。但是这些研究大多只停留在成分提取研究这一层面，为了更好地充分合理利用龙眼叶药材资源，因此有必要深入研究龙眼叶，阐明其降低血糖的物质基础及其作用机理。

1.1 实验材料与试剂

龙眼叶购置广东省茂名市信宜区龙眼叶种植基地。芦丁标准品(HPLC>98%)，上海源叶生物科技有限公司；
对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，99%)，上海源叶生物科技有限公司；
α-葡萄糖苷酶(50 U·mg-1)，上海源叶生物科技有限公司；
磷酸缓冲盐溶液(pH 6.8，0.1 mol·L-1)，国药集团化学试剂有限公司；
阿卡波糖(56180-94-0BR型，95%)，上海源叶生物科技有限公司；
无水三氯化铝，无水碳酸钠，无水乙醇等分析纯，实验所用蒸馏水。

1.2 仪器与设备

KQ-600KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
T6新世纪型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；
AR224C型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；
LDZF-50KB-Ⅲ型立式压力灭菌锅，上海申安医疗器械厂；
HH-4型数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；
RE-52C型旋转蒸发仪，上海青浦沪西仪器厂；
GZX-9240MBE型数显鼓风干燥器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
Epoch型全波长酶标仪，基因有限公司。

1.3 波长的选择

首先将芦丁的标准品溶液调配至适应的浓度，浓度配比设定为0.2 mg·mL-1；
选定的剂量为1 mL，将标准溶液置于选作为容器的25 mL容量瓶中。然后配制浓度控制为1.5%的AlCl3溶液，再取5 mL配制好的AlCl3溶液混入容量瓶当中摇晃均匀。完成上述步骤后再按照60%的浓度标准配制乙醇混合液，再次将60%乙醇缓慢加入容量瓶当中，滴定到刻度线后充分混合。将空白对照组设定为60%乙醇，使用紫外分光光度计展开扫描，波长数值控制在200～700 nm。重复5次上述实验步骤，测得本实验的最适波长为417 nm，故测定时选用此波长。

1.4 标准曲线的绘制

采用紫外分光光度法进行测定，分别吸取0.2 mg·mL-1芦丁标准品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL放入到6个规格为25 mL的容量瓶当中，再配制浓度控制为1.5%的AlCl3溶液，分别取5 mL配制好的AlCl3溶液混合到这6个容量瓶中。均匀的晃动后用60%乙醇溶液定容至刻度线，获得本实验的芦丁对照品。然后把60%乙醇作为空白的对照组，最后选择417 nm的波长展开对照品溶液的吸光度测试[8]。将实验所得结果绘制成标准曲线，将吸光度(A)设为纵坐标，芦丁对照品浓度(mg·mL-1)设为横坐标。

1.5 龙眼叶总黄酮的提取

取新鲜龙眼叶，洗干净之后，然后在50 ℃的环境下进行烘干处理，经过粉碎机粉碎后过40目筛，得到龙眼叶粉末。然后对龙眼叶中的总黄酮进行提取，具体的操作流程如下：提前选取6 g处理好的龙眼叶粉末，按照95%的浓度标准配置乙醇溶液，在龙眼叶粉末中加入80 mL配制好的95%乙醇溶液，使用超声波设备进行提取，时间持续2.5 h，最后使用抽滤装置进行抽滤。得到的残渣物质再次加入配制好80 mL的95%乙醇溶液，再次进行超声波提取和抽滤。经过两次提取后保留抽滤后的滤液，再通过旋转蒸发仪对乙醇物质进行减压回收，由此得到龙眼叶中的总黄酮，将其置于锥形瓶中冷藏储存[9]。

1.6 总黄酮的含量测定

吸取5 mL的样品备用，然后挑选规格为25 mL的容量瓶，将样品直接放入到容量瓶中。另外再配制浓度控制在1.5%的AlCl3溶液，使用移液枪吸取5 mL并混合到容器当中将其摇匀。完成以上步骤后添加60%乙醇溶液至容器中，将其定容到刻度线并摇匀。最后以60%乙醇为空白对照组，将混合溶液稳定放置30 min后，在417 nm波长处测定吸光度。

样品中总黄酮的含量(mg·g-1)=(Y×V1)/(m×V)

式中：Y为从回归方程求得芦丁量，mg；
V1为样品溶液总体积，100 mL；
V为测定时取样体积，5 mL；
m为样品质量，g。

1.7 龙眼叶总黄酮的降血糖活性测定

实验设定几个不同条件的组别进行，分为样品组、背景组、空白组、体系空白组。背景组用以消除待测样品溶液产生的吸光值误差，体系空白组用以消除待测样品溶液本身带来的颜色误差。对待测样品进行降血糖活性测定，具体的操作流程如下：在96孔板中，依次按照不同组别的要求加入表1所示的各种试剂，用设定的5个不同浓度待测样品分别进行α-葡萄糖苷酶抑制活性试验，待测试剂加入完毕后，将96孔板放入水浴锅中，反应温度设定为37 ℃，反应时间设定为15 min。再对各个实验组分别添加对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，容量控制在10 μL，反应温度设定为37 ℃，反应时间设定为30 min。然后再加入0.1 mol·L-1Na2CO3溶液100 μL终止实验[10]。使用酶标仪测定各个反应组的吸光度A，测定波长设定为405 nm，用下方公式[11]分别计算各个浓度的待测样品对α-葡萄糖苷酶抑制率。每个浓度做3个复孔，最终抑制率取三孔平均值。

阳性对照药品为市面上出售的降血糖药物阿卡波糖。

分别将实验所得结果绘制折线关系图，将不同浓度待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率设为纵坐标，待测样品的浓度设为横坐标，对比并分析实验结果。

表1 实验分组所加试剂及试剂用量Table 1 Reagents added and reagent dosage in experimental grouping (μL)

2.1 龙眼叶总黄酮的含量测定

按1.5方法提取龙眼叶中的总黄酮，并用1.6方法对龙眼叶总黄酮进行含量测定，通过测定和计算得知原样品中总黄酮的浓度为0.11403 mg·mL-1，样品中总黄酮含量为0.3753 mg·g-1。

2.2 龙眼叶总黄酮降血糖活性测定

2.2.1 龙眼叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制能力

按1.7方法对0.15、0.2、0.25、0.3和0.35 mg·mL-1龙眼叶总黄酮的酶活性进行检测，每个浓度使用3个复孔，进行相应的平行实验，将测得的吸光度来计算其SD值和平均值。可以从图1当中看出龙眼叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，在五个不同浓度的条件下得出的抑制率数值分别为：49.7%±2.7%、55.62%±2.66%、65.09%±2.69%、69.23%±2.23%和72.37%±2.11%。从实验结果中可以看出，随着龙眼叶总黄酮浓度的升高，对酶活性的抑制效果也随之升高，呈现出明显的量效依赖关系。而当浓度降低至0.15 mg·mL-1时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率约为49%，因此龙眼叶总黄酮在一定程度下会具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

图1 龙眼叶总黄酮浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率关系图Fig.1 Relationship between total flavonoid concentration in longan leaves and α-glucosidase inhibition rate

2.2.2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力

图2 阿卡波糖浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率关系图Fig.2 Relationship between Akapoose concentration and α-glucosidase inhibition rate

按1.7的方法对0.01、0.05、0.1、0.3和0.5 μg·mL-1阿卡波糖的酶活性进行检测，每个浓度使用3个复孔，进行相应的平行实验，将测得的吸光度来计算其SD值和平均值。可以从图2当中看出阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，在五个不同浓度的条件下得出的抑制率数值分别为：21.89%±2.18%、26.63%±2.90%、55.03%±4.38%、66.86%±2.94%和69.23%±3.14%。根据实验结果得知在0.3 μg·mL-1的阿卡波糖溶液和0.25 mg·mL-1龙眼叶总黄酮测出的抑制率一致，说明在此浓度时，龙眼叶总黄酮的降血糖能力与阿卡波糖的降血糖能力相近。

从以上实验结果可以发现，龙眼叶总黄酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的能力，虽然与阳性对照药阿卡波糖相比，其抑制酶活性的能力较弱，但是该实验结论为提取纯化龙眼叶中的总黄酮用以开发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物提供了新的思路，可作为未来动物体内降血糖研究的实验理论基础。

本实验使用超声波法提取龙眼叶总黄酮，选择芦丁作为实验中总黄酮的标准品，绘制出对应的曲线关系，建立标准曲线，然后使用紫外可见分光光度计对当前龙眼叶总黄酮的吸光数值展开测量。通过计算得出，龙眼叶总黄酮含量为0.3753 mg·g-1。在进行多组平行试验的基础上，测得龙眼叶总黄酮浓度区间在0.15～0.35 mg·mL-1时，总黄酮浓度越高，对α-葡萄糖苷酶的抑制率越高，从而得知浓度和抑制作用呈正相关，并且0.25 mg·mL-1的龙眼叶总黄酮与0.3 μg·mL-1阿卡波糖溶液的抑制率一致。

本实验得出的结论是：龙眼叶可提取出总黄酮，并且龙眼叶总黄酮具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。这项结论为未来研究降血糖的动物体内实验提供理论基础。本实验虽然没有对提取工艺进行优化，以筛选出总黄酮含量高、酶抑制活性强的提取工艺，但是本实验显示出龙眼叶具有较大的开发价值，揭示了龙眼叶总黄酮具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。进一步深入研究龙眼叶的作用前，除了研究最佳提取工艺以外，还可再增加纯化的步骤，也许会对降血糖的效果有更明显的体现。相信随着科技的进步和工艺的创新，人们对龙眼叶有效成分、作用机制及生物转化进行深入研究后，以龙眼叶为原料可能在开发新型药物，有效治疗糖尿病中发挥巨大作用。

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