石生黄堇种子生理及萌发特性△

于尚平，郭巧生*，赵开军，刁和芳，刘丽，刘畅，景定坤，朱莹莹

1.南京农业大学 中药材研究所，江苏 南京 210095；

2.南京中山制药有限公司，江苏 南京 210000

岩黄连为罂粟科紫堇属植物石生黄堇Corydalis saxicolaBunting.的全草，味苦，性凉，具有清热解毒、利湿、止痛止血之功效，主治肝炎、口舌糜烂、火眼等[1-2]，是广西西北山区治疗肝炎和肝硬化等疾病的常用药[3]。目前，对其研究主要集中在化学成分、药理方面，在种植栽培方面只有一些经验总结。例如，蒋水元等[4]对不同品种、着生部位、贮藏方法的石生黄堇种子进行初步探索研究；
李翠等[5]在此基础上发现石生黄堇种子仅在收获后3 个月内有活力，种子萌发率只有15%～30%；
陈晓英等[6]对石生黄堇光合特性进行了系统研究；
王冬梅等[7]初步探索了药材产地加工方法对岩黄连品质的影响。对种子萌发特性、资源分布、生长发育规律、有效成分的积累规律等方面研究较少，缺乏系统深入的试验研究。随着石生黄堇的药用价值被发掘，其市场需求量不断扩大，野生资源无法满足市场需求。在人工栽培试验中发现，石生黄堇繁殖系数低下，这是其规范化栽培的主要障碍。因此，本课题组对石生黄堇种子生理及萌发特性进行了系统研究，旨在为其规范化栽培提供参考。

1.1 样品

于2021 年5 月采自广西壮族自治区河池市东兰县的栽培植物，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为石生黄堇Corydalis saxicolaBunting.种子，采收后室内自然晾干。

1.2 仪器

DVM6a 型超景深显微镜[茂盛实业（上海）有限公司]；
19 cm×14 cm 发芽盒（南京晶格化学科技有限公司）；
GXZ-260B 型智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）；
BMS-120.4型分析天平（上海卓精电子科技有限公司）；
DELTA 320型pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.3 试药

盐酸（批号：160725196H）、氢氧化钠（批号：20210406）均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2.1 外形基本特性

取石生黄堇种子20 粒，观察种子形状、色泽、光滑度、质感等，在超景深显微镜下测量种子大小，总结种子形态特征。

2.2 吸水率的测定

取石生黄堇净种子0.3 g，置于烧杯中，加入蒸馏水30 mL 自然吸涨，定期用吸水纸吸干种子表面水分后称质量，直到最后2 次测定值相差不超过0.05 g为止，3次重复，按公式（1）计算吸水率。

2.3 萌发抑制物的生物测定

取粉碎的石生黄堇种子3 g置于锥形瓶中，加入蒸馏水20 mL，保鲜膜封口后在4 ℃冰箱内浸提，每隔6 h 振荡1 次，浸提24 h 后取出，作为第1 天的浸提液，将含有种子粉末的锥形瓶中再加入蒸馏水20 mL，按上述方法反复浸提至第3天。将浸提液用于白菜种子发芽试验，以等体积蒸馏水为对照（CK），统计白菜种子的萌发情况。将浸提液存放于4 ℃的冰箱中贮藏备用。

2.4 休眠特性检验

取健康饱满的石生黄堇种子，去除种皮后置于铺有滤纸的培养皿中，放于15 ℃/25 ℃（模拟自然的变温条件即1 d 内将种子置于25 ℃条件下12 h、15 ℃条件下12 h，如此反复循环）黑暗条件下培养，观察种子的萌发情况。

2.5 不同发芽条件下种子发芽率测定

2.5.1适宜浸种时间的确定 选取饱满、大小基本一致的石生黄堇种子，在室温条件下分别浸种24、36、48、60、72 h，于15 ℃/25 ℃黑暗条件下砂床进行发芽试验。

2.5.2适宜发芽床的确定 选取饱满，大小基本一致的石生黄堇种子，室温条件下用蒸馏水浸种60 h，分别置于以下发芽床，于15 ℃/25 ℃黑暗条件下进行发芽试验。各处理如下：1）在培养皿中铺上2 层湿润的滤纸，置种；
2）在培养皿上铺2 层湿润并消过毒的无纺纱布，置种；
3）在培养皿上铺2 层湿润并消过毒的无纺纱布，置种，然后在种子上面铺1层纱布；
4）在培养皿中放入过60 目筛并用高温消毒的细砂20 g（砂水体积比为4∶1），置种；
5）把滤纸折叠，将种子置于褶沟处。

2.5.3适宜温度和光照的确定 选取饱满、大小基本一致的石生黄堇种子，种子洗净后，用蒸馏水浸种60 h，吸水纸吸干种子表面水分。设计10、15、20、25、30 ℃及10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃ 7 个处理，并将各温度处理的种子分别放在光12 h/暗12 h（光照强度为弱光）、全黑暗条件下，定期浇水，观察种子萌发情况。

2.5.4适宜pH 的确定 选取饱满、大小基本一致的石生黄堇种子，室温条件下自来水浸种60 h，吸水纸吸干种子表面水分，分别用盐酸和氢氧化钠配制酸性和碱性母液，将酸碱母液及pH 为7 的蒸馏水分别加入砂床（砂子用去离子水清洗3 遍，于121 ℃条件下进行高温灭菌处理）上，调节湿砂的pH 为5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0（用pH 计测定），于15 ℃/25 ℃黑暗条件下进行发芽试验。

2.6 不同贮藏方式对石生黄堇种子萌发的影响

选取刚采收的饱满、大小基本一致的石生黄堇种子，在室温条件下自然干燥3～5 d 后，按以下4 种方式贮藏。1）4 ℃低温干藏：种子置于纸袋中，于4 ℃冰箱中贮藏；
2）4 ℃低温砂藏：将洗净的河沙筛成粗砂（18 目）和细砂（40 目），经高温灭菌（121 ℃，30 min）后，在容器底部铺粗砂3～5 cm，再铺细砂5～10 cm，将石生黄堇种子装入纱布网袋中，平铺于细砂上，再盖细砂5～10 cm，细砂相对湿度为15%左右，用保鲜膜封住容器，打孔透气，将容器置于冰箱中；
3）15 ℃非密闭干藏：种子放入袋中，于15 ℃条件下贮藏；
4）15 ℃密闭干藏：种子放入种子袋中，置于密闭的塑料贮藏罐中，于15 ℃下进行贮藏。

2.7 测定指标

以种子根茎处胚芽伸出2 mm 时的天数作为初次计数时间，以种子萌发数达到最高、以后再无萌发种子出现时的天数作为末次计数时间，采用公式（2）～（3）计算发芽势、发芽率。

2.8 数据分析

采用Microsoft Excel 2019 软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 24 软件对数据进行差异显著性检验。

3.1 石生黄堇种子及果荚基本特性

如图1A～B所示，石生黄堇种果为蒴果，长3.0～5.1 cm，扁条形或线形、略弯曲，成熟时2 瓣裂，内含种子20～30粒。如图1C～D 所示，石生黄堇种子长0.91～1.12 mm，宽1.20～1.41 mm，厚0.62～0.76 mm，肾形或椭圆形，表面黑色或棕黑色，有光泽，种皮坚硬，有致密的蜡质层和角质层，表面为网纹型纹饰，种脐位于干截面的中间，略凹陷，其上有白色或浅黄色鸡冠状的油质体种阜，种孔位于种脐旁边，被种阜所覆盖。

图1 石生黄堇果荚及种子形态

3.2 石生黄堇种子吸水曲线

由图2 可知，石生黄堇种子吸水过程大致可以分为3 个阶段：第1 阶段为0～2 h，是种子急剧吸水的阶段，吸水率已近50%；
第2 阶段为2～22 h，此阶段为种子缓慢吸水的时期，种子吸水量缓慢增加；
第3 阶段22 h 之后，种子吸水率基本上处于稳定状态，吸水率达到70%以上。由此看出，石生黄堇种子虽质地坚硬，种皮革质，但是其吸水无障碍，在24 h 内基本上可以达到饱和状态，满足种子萌发所需要的水分。

图2 石生黄堇种子吸水曲线

3.3 石生黄堇种子萌发抑制物的生物测定

第2 天的种子浸提液对白菜种子发芽率、根长、茎长抑制作用最强，与CK、第3 天差异有统计学意义（P＜0.05），由此可以推断出，种子中存在某种物质抑制其萌发，该抑制物质至少需要48 h 才能完全可以溶于水中，第3 天浸提液中白菜种子的发芽率、根长、茎长与CK 相差无几，与第1、2 天差异有统计学意义（P＜0.05），可能与某些易溶于水的萌发抑制物在浸提期间发生了水解、氧化、拮抗等作用有关。因此，将种子浸泡在水中48 h 以上，基本上能降解萌发抑制物（表1）。

表1 不同浸提时间对白菜种子发芽率、根长及茎长的影响（,n=3）

表1 不同浸提时间对白菜种子发芽率、根长及茎长的影响（,n=3）

注：同列不同小写字母表示P＜0.05；
表2～6同。

3.4 石生黄堇种子休眠特性的检验

经过30 d培养，培养皿中的石生黄堇种胚均未发芽（图3A），可以看出大部分种胚具有休眠性。如图3B～C所示，种子存在形态发育不完全的现象。

图3 石生黄堇种子胚发芽及发育状态

3.5 不同发芽条件下种子发芽率的测定

3.5.1适宜发芽床的确定 砂上种子的发芽率最高为60.00%，纸上与砂上无明显差异，而棉间种子的发芽率最低为27.33%（表2）。可能是石生黄堇种子细小，种子在棉间承受的阻力较大，种胚难以突破伸长，导致在棉间的发芽率最低。在实验的过程中发现，砂上种子的启动日期相较其他发芽床明显提前，以棉为发芽床的种子发霉现象严重，可能与棉的保水性强、透气性较差有关，故选择砂床较为适宜。

表2 不同发芽床对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

表2 不同发芽床对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

3.5.2适宜浸种时间的确定 如表3 所示，在24～72 h，随着浸种时间的增加，种子的发芽势、发芽率均呈现先上升再下降的趋势，且在浸种60 h 时，种子的发芽势、发芽率均为最高，故选择浸种60 h为宜。

表3 不同浸种时间对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

表3 不同浸种时间对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

3.5.3适宜发芽温度和光照 由表4可知，10～25 ℃条件下石生黄堇种子均可发芽，温度高时发芽速度快，15 ℃/25 ℃黑暗条件下，发芽率最高为68%，且变温条件下发芽率略高于恒温条件下石生黄堇种子的发芽率。适宜温度范围内，光照与否对石生黄堇种子发芽率的影响不明显，若温度不适，光照为影响种子发芽的主要因素。

表4 不同温度和光照条件下石生黄堇种子萌发情况（,n=3）

表4 不同温度和光照条件下石生黄堇种子萌发情况（,n=3）

3.5.4发芽适宜pH 的确定 由表5 可知，在pH 3～11条件下，其发芽率先增加再下降，pH在5、7、9、11 发芽率差异无统计学意义，说明石生黄堇种子萌发对土壤酸碱度要求不严，在pH 为7 时发芽率最高，为72%。

表5 不同pH对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

表5 不同pH对石生黄堇种子萌发的影响（,n=3）

3.5.5发芽初次和末次计数时间 从图4 可知，石生黄堇种子启动时间较晚，9 d 后才陆续发芽，第9～20 d发芽速度明显加快，发芽20 d后，种子发芽速度明显下降，并趋于平稳，整个发芽周期为1～23 d，第9天为初次计数时间，第23天为末次计数时间。

图4 石生黄堇种子发芽率与时间的关系

3.6 不同贮藏方式对石生黄堇种子萌发的影响

从表6 可知，石生黄堇种子不耐贮藏，采用4 ℃湿藏的方式，贮藏4 个月发芽率基本上可以保持在60%左右，贮藏第3 个月发芽率最高为76%；
4 ℃干藏3 个月下降极其显著，贮藏6 个月种子发芽率就降到20%左右，说明在温度较低贮藏时，湿藏处理有利于种子保持生理活性，使胚不断发育成熟。采用15 ℃干藏（接近种子萌发的温度）贮藏6个月，发芽率基本上也可保持在40%左右。

表6 不同贮藏方式下石生黄堇种子的发芽率（,n=3）

表6 不同贮藏方式下石生黄堇种子的发芽率（,n=3）

石生黄堇为岩溶石山地区特有的多年生草本植物，局限分布裸露石山，生于石缝、石穴[8]，生长环境极其恶劣。其种子自然繁殖率低，种群资源更新困难，主要原因包括：1）石生黄堇种子本身生活力低下。通过研究发现石生黄堇种子生活力水平较低，可能与花期生存条件恶劣，如偶有骤寒使球花败育、花期多雨阻碍授粉、种子采收后的干燥贮藏方式有关，具体原因有待于进一步探究。2）生物因素、生态环境导致种子种皮坚硬。岩溶山区地表容易渗漏，土壤耕作浅，蓄水能力差，极易发生干燥，石生黄堇为了适应这种缺水干旱的环境，不断增厚种皮结构，因此种子吸水达到饱和状态需要更多的时间。试验中发现虽然存在种皮坚硬的问题，但是不影响种子吸水性，可通过较长时间浸泡软化种皮，同时此过程也起到降解萌发抑制物的作用。3）种子发育状态不一致。由于长期的进化，植物具有特殊的种子传播及萌发策略，确保在合适的时间和地点下进行种子的萌发与幼苗的建成，但是由于亲本之间存在遗传差异性，或者在资源环境不足的条件下资源分配的差异，导致个体差异。这也是石生黄堇果穗中部的种子发芽率高于顶部和基部的发芽率、不同采收部位发芽率存在差异可能的原因[9]。通过试验发现，部分种子还存在胚发育不一致的状况，可通过砂藏100 d的方法，发芽率可达76%，进一步提高了种子发芽的整齐度。4）种子存在萌发抑制物。种子内源抑制物即化感物质是导致种子休眠的主要原因，在药用植物中普遍存在，如蒙古黄芪[10]、延胡索[11]、贝母[12]等。本研究发现石生黄堇种子存在能溶于水的萌发抑制物，浸泡60 h 基本可以降解，从而促进种子的萌发，但是过长时间浸种，也会使种子的细胞结构损伤，进而影响种子的发芽率。5）种子采后干燥方式很重要。石生黄堇狭域分布在中国西南部，自然环境先天脆弱、资源量比较少，当地农户在采收季节采收好种子后一般放在阳光下晒干或者直接放在大棚内晾干，此时温度较高，太阳辐射相对较强，种子内部水分急剧蒸发下降，自由水尽失，导致种子活力降低甚至完全丧失活性，虽然外表发亮完整，但是内部种子干瘪，也解释了晒干处理在不同干燥处理（鲜种、晒干、阴干）方法中，发芽率最低的原因，也为后续进一步研究种子含水量与种子发芽的情况打下了坚实的基础。6）种子不耐贮藏。种子贮藏的首要任务是为了保证种子的活力以延长种子的寿命，种子在贮藏过程中，温度和含水量是种子贮藏的2 个主要的参数，在温度较低（4 ℃）进行贮藏时，湿藏可以使种子保持生理活性，使胚不断发育成熟。本研究前期也尝试过15 ℃湿砂层积的方法，砂藏层积20 d 左右就发芽，因此在15 ℃下进行贮藏时适合采用干藏方法。

石生黄堇种子属综合休眠型，种子虽种皮坚硬，但种皮透水性良好，满足种子萌发所需要的水分；
部分种子还存在胚发育不完全和萌发抑制物的现象。通过对石生黄堇种子的外部环境条件的摸索，发现适宜石生黄堇种子萌发的条件为春天种子采收后进行室内阴干处理3～5 d 后，清水浸种60 h、15 ℃/25 ℃黑暗条件、pH 偏中性的砂床。石生黄堇种子不耐贮藏，最好随采随播；
若短期贮藏可以采用低温湿藏的方法贮藏3 个月，发芽率可达到76%；
若需要长期贮藏可采用15 ℃密闭干藏，发芽率基本可保持在40%左右。

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